Nữ vương Juana xuất thân từ gia tộc nhà Trastámara lừng danh của hai Vương quốc cổ Castilla và Aragon, bà được sinh ra ở Toledo, kinh đô khi đó của Vương quốc Castile. Bà là người con thứ 3 và là con gái thứ hai của Quốc vương Fernando II của Aragon và Nữ vương Isabella I của Castilla. Trong gia đình hầu hết là con gái, Juana là chị của Catherine xứ Aragon, người sau này lấy Henry VIII của Anh và trở thành Vương hậu nước Anh.

Từ khi còn nhỏ, Juana là một người được đánh giá là thông minh và siêng năng, đồng thời là một học sinh giỏi. Mẹ bà là Nữ vương Isabella thường lui tới phòng học và kiểm tra bài vở của bà cùng với ba chị em gái khác là Isabella, Maria và Catherine.